D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Colletotrichum coccodes onddo fitopatogenoak gaixotasun arriskutsuak eragiten ditu antracnosa eta tuberkuluaren puntu beltza izenarekin ezagutzen diren patata eta tomateetan. Ezaugarri morfologikoen arabera, zaila izaten da beste mikroorganismo batzuek eragindako gaixotasunetatik bereiztea; tomate berdeen fruituetan, gaixotasuna sintomatikoa izan daiteke, fruitu gorri helduetan soilik ager daiteke. Patogenoaren diagnostiko azkarra eta zehatza egiteko, denbora errealeko PCR proba sistema eskaintzen da. Proba sistema garatzeko, Errusiako eskualde desberdinetan patata tuberkuluetatik isolatutako 45 C. coccodes anduien glizerol trifosfato deshidrogenasaren genearen nukleotido sekuentzia zehaztu zen.
Lortutako emaitzetan eta GenBank datu basean eskuragarri dauden beste espezie batzuen antzeko sekuentzien analisian oinarrituta, espezie espezifikoen primerak eta C. coccodesen zunda diseinatu ziren. Sortutako proba-sistemaren berezitasuna egiaztatzeko, PCR tomate eta patata landareekin lotutako Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodesekin lotutako 15 onddo parasito eta saprotrofo espezie desberdinetatik isolatutako ADNarekin egin da. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes DNAren presentzia 20-27 arteko atalase zikloan zehaztu zen, beste espezie batzuk 40 zikloren ondoren detektatu ziren edo ez ziren antzeman. Azterketa-sistemak aztertzen duen PCR nahasketan C. coccodes DNA kontzentrazioak 0.01 ng / mm3-tik gorakoak modu fidagarrian hautemateko aukera ematen du. Garatutako proba sistema erabiliz, C. coccodesen onddoen gaixotasunen sintomak dituzten tomate hostoetan eta gaixotasunaren kanpoko sintomarik gabeko patata tuberkuluetan ikertu zen. Onddoen infekzioaren sintomak dituzten hostoak Krasnodar Lurraldeko bi soro desberdinetatik bildu ziren, tuberkuluak - Kostroma, Mosku, Kaluga, Nizhny Novgorod eskualdeetako soroetatik. C. coccodes DNA duen tomate hosto bat aurkitu zen Krasnodar Lurraldean; patogeno horren DNAren presentzia nabarmena antzeman zen Kostroma, Mosku eta Kaluga eskualdeetan hazitako 5 tuberkulu laginetan.
Sarrera
Colletotrichum generoko onddoak zerealak, barazkiak, belarrak, fruitu iraunkorrak eta baia landareak eragiten dituzten fitopatogeno arriskutsuak dira. Genero honetako espezie nonahikoetako bat, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, antracnosiaren eta patata eta tomateen orban beltzaren eragilea da, eta Solanaceae familiako beste landare batzuen gaixotasunak eragiten ditu, barne. belar txarrak (Dillard, 1992). C. coccodes landarearen lurpeko zati guztietan, zurtoin oinarrietan, hostoetan eta fruituetan eragiten du (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Kutsatutako patata tuberkuluen azalean, argi nabarmentzen diren ertzak dituzten orban grisen garapena ikusten da, eta horietan argi ikusten dira esporulazio eta mikrosklerotia puntu beltzak. Biltegiratzean, edukia leundutako ultzerak sor daitezke tuberkuluen mamian, hau da, gaixotasuna antraknosiaren fasean sartzen da, baina oso arraroa da.
Aldi berean, antracnosiaren sintomak (puntu beltz txikiak dituzten larruazaleko ultzerak) ohikoak dira tomate fruituetan. Hostoetan, C. coccodes-en sintomak orban marroi ilunak dirudite, normalean ehun horiak mugatuta (Johnson, 1994).
Tuberkuluetan orban beltzaren garapenak haien itxura hondatzen du, batez ere azal gorriko patata garbituak saltzerakoan nabarmentzen dena. Zuritu esfoliatzeak gehiegizko lurrunketa eta biltegiratze galerak handitzen ditu (Hunger, McIntyre, 1979). Landareen beste organo batzuek kalteak etekin galerak ekartzen ditu, lur ireki zein itxietan nabaritu zen (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). C. coccodesek eragindako gaixotasunak ohikoak dira munduko patata ekoizten duten ia eskualde guztietan, Errusian barne (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Gaixotasun horien kontrola zaila da C. coccodesen aurkako fungiziden eraginkortasun eskasa eta barietate erresistenterik ez dagoelako (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inoculum hazi tuberkuluetan (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomate hazietan (Ben-Daniel et al., 2010) iraun dezake lurzoruan, landare hondakinetan (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) eta belar txarrean (Raid, Pennypacker, 1987). Zenbait egileren lanek (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) erakutsi dute patatetan eta tomateetan gaixotasuna garatzea neurri handi batean hazietan inokuloa egotearen eta. lurzorua. Hori dela eta, gaixotasunaren galerak minimizatzeko, beharrezkoa da onddoaren propagulak haziaren materialean, lurrean, biltegiratzeko jarritako hazien patata tuberkuluetan eta tomate hazietan diagnostikatzea (kuantitatiboa barne). Lurzoruaren eta landareen materialen diagnostiko morfologikoa mikrosklerotiak egotearekin bakarrik egin daiteke, baina beste onddo mota batzuetan ere aurkitzen dira.
Tuberkuluetako sintomak Helminthosporium solani onddoak eragindako zilarrezko azala bezalakoak dira. Colletotrichum coccodes eta Helminthosporium solani kultura hutsean isolatzea nahiko zaila da eta denbora asko behar da elikagai-euskarri batean hazkunde motela dela eta. Colletotrichum coccodes azkar identifikatzeko, beharrezkoa da diagnostiko instrumentaleko metodoak erabiltzea. Metodorik erosoena polimerasaren kate-erreakzioa (PCR) eta haren aldaketa - denbora errealeko PCR da. Gaur egun, ikerlari britainiarrek (Cullen et al., 2002) ITS1 rDNA eskualderako garatutako proba sistema erabiltzen da Europan eta Estatu Batuetan. Bere erabilerak emaitza onak erakutsi ditu Errusiako isolatuen analisian (Belov et al, 2018). Hala ere, C. coccodes oso aldakorra da eta DNA sekuentzia bakar batetik detektatzeak emaitza negatibo faltsuak ekar ditzake. Diagnostiko fidagarriagoa lortzeko, espezie espezifikoen DNA sekuentzia batzuetarako analisia egin behar da, eta, beraz, glokeraldehido-3-fosfato deshidrogenasa genearen sekuentziaren bidez C. coccodes identifikatzea ahalbidetzen duen test sistema originala garatu dugu.
materialak eta metodoak
Sortutako saiakuntza sistemen eraginkortasuna eta espezifikotasuna ebaluatzeko, egileek tomate hosto eta fruituen, patata tuberkuluen gaixotasun laginetatik 15 onddo espezieen kultura puruak erabili ditugu (1. taula). Isolamendurako, onddoen infekzioaren sintomak dituzten landareen organoak hartu ziren, zuhaixka bakoitzeko organo bat baino gehiago.
Azala duen tuberkulu baten xerra, tomate fruituaren xerra eta kaltetutako hosto bat mikroskopio binokular baten azpian jarri ziren eta, ondoren, mizelioa, esporak edo ehun zati bat agar ertainera (wort agar) transferitu ziren Petri plaka batean disekzio orratz zorroztuarekin. Isolamenduak agar inklinazioan gorde ziren probetako probetan, 4 ° C-tan.
Bildu eta berehala (zelaian) aztertzeko pentsatutako onddoen gaixotasunen sintomak dituzten tomate hostoen laginak% 70 alkohol etilikoan jarri ziren eta bertan gorde ziren DNA isolatu arte. Patata tuberkuluak laborategira entregatu, zuritu (2 × 1 cm-ko pieza) bertatik eta izoztu ziren –20 ° С. Izoztuta gordetzen da DNA isolatu arte.
DNA isolatzeko onddoen kultura puruak ilar likido ertainean hazten ziren. Onddoaren mizelioa euskarri likidoetik atera zen, iragazki paperean lehortu zen, nitrogeno likidoan izoztu zen, homogeneizatu egin zen, CTAB bufferrean inkubatu, kloroformoarekin purifikatu, isopropanol eta 0.5 M potasio azetato nahasketa batekin prezipitatu zen, birritan garbitu zen% 2 alkoholarekin. Lortutako DNA ur desionizatuetan disolbatu eta –70 ° С-tan gorde zen (Kutuzova et al., 20). ADNaren kontzentrazioa kate bikoitzeko DNAren HS AD kuantifikazio-kitaren bidez neurtu da Qubit 2017-n (Qiagen, Alemania). Alkoholizatutako eta izoztutako laginak nitrogeno likidoan trituratu ziren, ondoren ADN erauzketa egin zen goian deskribatutako moduan (onddoen kultura puruen mizeliorako).
1. taula. Erabilitako onddoen anduien jatorria
Perretxikoen izena | Landarea, organoa | Aukeraketa lekua |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | patata tuberkulua | Kostroma eskualdea, 1. eremuko belaunaldiko patata-tuberkuluak, Red Scarlett cultivar |
Colletotrichum cocodes 4 | patata hostoa | Errep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | patata tuberkulua | Magadan eskualdea, pos. Karpa, patata tuberkulua |
Cladosporium fulvum | tomate hostoa | Moskuko eskualdea, fruitu handiko tomatea |
Alternaria tomatephila | tomate fruta | Landareen Babeserako Errusiako Ikerketa Institutuko mikologia eta fitopatologia laborategiko langileek aurkeztua |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomate fruta | Krasnodar Lurraldea, Krymsky barrutia, Cream maila |
Fusarium oxysporum | gari erroa | Moskuko eskualdea |
PCR DTprime anplifikadore batean (DNA-Technology) egin zen. PCRrako, jatorrizko primerak eta glizerol trifosfato deshidrogenasaren genearen espezie espezifikoetarako zunda bat erabili ziren: Coc70gdf-aitzindari primer -TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, alderantzizko primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Primerrek 213 bp-ko eskualdea anplifikatzen dute.
Erreakzioak 50 ng DNA oso (hostoen eta tuberkuluen analisian) eta 10 ng (onddoen kultura puruen DNAren analisian) hartu zituen. Erreakzio nahasketa (35 μl) parafinazko geruza batez zatitu zen bi zatitan: behekoak (20 μl) 2 μl zituen 10 × erreakzio buffer (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2;% 0.1 Tween- 20), 0.5 mM desoxinukleotido trifosfato bakoitzeko, 7 pmol primer bakoitzeko eta 4 pmol zundaketa fluoreszente hidrolizagarri baten; goikoak 1 × PCR buffer 10 μl eta Taq polimerasa 1 U zituen.
Nahastea parafinarekin bereizteak, hodiak 5 ° C-ko tenperaturan denbora luzez biltegiratzea eta PCR-ri hasiera beroa ematea ahalbidetzen du 10 minutuz 80 ° C-tik gorako tenperaturan berotu ondoren. PCR programa honen arabera egin da: 94.0 ° C - 90 s (ziklo 1); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ziklo); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ziklo); 10.0 ° C - biltegiratzea.
Emaitzak eta eztabaida
Glizerol trifosfato deshidrogenasaren genearen sekuentziak Errusiako eskualde desberdinetan hosto, zurtoin, patata tuberkulu eta tomate fruituetatik isolatutako 45 anduietan zehaztu ziren. Tentsio guztien azterketako sekuentziak bi nukleotidotan bereizten diren 2018 taldetan banatu ziren. Bi taldeetako ordezkarien nukleotidoen sekuentziak KY2 eta KY496634 zenbakien azpian daude GenBank-en.
BLAST programaren bidez egiaztatu dira coc70gdf, coc280gdr eta cocgdz zundak primeran oinarritutako diseinuak.www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) Colletotrichum generoko glizerol trifosfato deshidrogenasaren genearen sekuentzia guztietan eta GenBank datu basean eskuragarri dauden beste organismo batzuetan.
Ez da topatzaileekin eta zundekin oso homologatutako beste organismo batzuen DNA eskualderik aurkitu.
Test sistemaren sentikortasuna C. coccodes DNA kontzentrazio desberdineko laginak erabiliz, antracnosarekin kutsatutako patata hosto baten DNA (2017an bildu zen Mari El, Red Scarlett barietatea) eta orban beltzak kaltetutako tuberkuluen azala (Kostroma eskualdean bildu ziren) egiaztatu zen. barietate Red Scarlett, 2. taula). Tuberkuluetan eta patata hostoetan ADNa dagoela berresteko, C. coccodes anduiak haietatik isolatu ziren kultura hutsetan.
Proba-sistemaren sentsibilitate-analisiaren emaitzek erakusten dute lagin batean C. coccodes DNAren presentzia arrakastaz diagnostikatzeko erabil daitekeela PCR nahastean duen eduki osoa 0.05 ng baino gehiago denean. Hori nahikoa da detektatzeko, izan ere, esklerotia batek batez beste 0.131 ng ditu eta espora batek 0.04 ng DNA inguru ditu (Cullen et al., 2002). Ingeles taldeak (Cullen et al., 2002) garatutako proba sistemak antzeko sentikortasuna erakutsi zuen (34. atalaseko zikloa 0.05 ng DNA-n eta 37 0.005 ng-tan).
C. coccodes duten lagin naturalen analisiak kasu guztietan laginean bere presentzia modu fidagarrian agerian uztea ahalbidetu zuen (2. taula). DNA isolatzeko proposatutako metodoa landare naturalen laginen analisietan ere aplikagarria zen.
2. taula. Colletotrichum coccodes identifikatzeko proposatutako proba-sistemaren sentsibilitatea zehaztea denbora errealeko PCRrako.
lagina | Laginaren DNA kopurua *, ng | Atalaseko zikloa | C. kokodeak hautematea |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Tuberkulu azala 1 | 50 | 32 | + |
Tuberkulu azala 2 | 50 | 30 | + |
Tuberkulu azala 3 | 50 | 31.5 | + |
Patata hostoa | 50 | 29.5 | + |
Ohar. * PCR produktuen nahasketan.
15 onddo espezietatik ateratako ADN laginetan egiaztatu da sistemaren espezifikotasuna. Egileek onddo mota guztiak isolatu zituzten tomate, patata tuberkulu eta fruitu eta hosto kaltetu eta osasuntsuetatik; tari bat gari-sustraitik isolatu zen (1. taula). Fruituaren gainazaletik isolatutakoen artean, tomatearentzat patogenoak ez diren espezieak daude (adibidez, Phellinus ferrugineovelutinus).
Ikerketek erakutsi dute C. coccodes DNA 20-27 atalaseko zikloan detektatu zela, beste onddo espezie batzuk ez zirela detektatu edo seinalerik eman 40. zikloaren ondoren, zarata eragin ez-espezifiko bati egotz dakiokeena (3. taula).
3. taula. Hainbat onddo mota aztertzeko sistema egiaztatzea
Perretxikoen izena | Atalaseko zikloa |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kokodunak 2 | 22.6 |
C. kokodunak 3 | 23 |
C. kokodunak 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. berticilioa | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatephila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Ohar. * Lagin guztietan DNA kopurua 10 ng zen.
Garatutako proba sistema tomate hosto laginetan C. coccodes identifikatzeko erabili zen, patogeno nekrotrofoen sintomak eta sintoma ikusgarririk gabeko hazien patata tuberkuluak dituztenak. Ikerketarako, Kostroma, Mosku, Kaluga, Nizhny Novgorod eskualdeetan hazitako barietate desberdinetako hazi tuberkuluak hartu ditugu. C. coccodes DNAren presentzia esanguratsutzat jo zen laginetan, eta horren analisian atalase zikloak ez zuen 35 gainditzen. Atalase balio hori hautatu zen C. coccodes DNA 0.05 ng-ko (33.5 atalase zikloa, 2. taula) zehaztapen fidagarriaren arabera. 40tik gorako atalase zikloetan, onddo espezie batzuen DNA inespezifikoa diagnostikatu zen. Ikuspegi honekin, C. coccodes DNAren presentzia nabarmena antzeman zen Kostroma, Mosku, Kaluga eskualdeetan hazitako 5 tuberkulu laginetan eta Krasnodar eskualdeko Yeisk barrutiko tomate hosto batean (4, 5 taulak).
4. taula. Colletotrichum coccodes detektatzea patata tuberkuluetan *
Laginaren zenbakia | Patata barietatea | Hazkunde tokia | C. kokodeak hautematea | Atalaseko zikloa |
---|---|---|---|---|
1 | Gorri eskarlata | Kostroma eskualdea | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskuko eskualdea | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky hasieran | Moskuko eskualdea | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga eskualdean. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasia | Kaluga eskualdean. | - | |
15 | gala | Nizhny Novgorod eskualdean. | - | |
16 | - |
Ohar. * Lagin guztietan DNA kopurua 50 ng zen.
5. taula. Colletotrichum coccodes detektatzea tomate hostoetan *
Laginaren zenbakia | Hazkunde tokia | C. kokodeak hautematea | Atalaseko zikloa |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar Lurraldea, Krimeako Barrutia | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar Lurraldea, Yeisk Barrutia | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Lagin guztietan DNA kopurua 50 ng zen.
Guk sortutako proba sistema ez da ikerlari britainiarrek (Cullen et al., 2002) sentikortasunean eta espezifikotasunean garatutakoa baino txikiagoa eta egokia da landare laginak aztertzeko. Hazien tuberkuluak aztertzeko egin duen aplikazioari esker, kanpoko kalterik ez duten tuberkuluetan C. coccodes DNA identifikatu eta hostoen infekzioa arrakastaz aztertu da.
Orain arte, Errusian ez da C. coccodes infestatzeko patata-tuberkuluen analisirik egin. Gure lehen ikerketak erakutsi du Errusiako Federazioko eskualde desberdinetan hazitako 16 hazitako tuberkuluetatik 5ek C. coccodes dituztela. Horrek erakusten du patataren tuberkuluen orban beltza patataren gaixotasun arrunta dela Errusian, eta patata laborearen bolumena eta kalitatea murrizteko duen egitekoa gutxiesten da.
Tomate hostoen analisiak agerian utzi du C. coccodes DNAren presentzia nabarmena dela Krasnodar Lurraldeko Yeisk barrutiko hosto batean. Lehenago, Errusia hegoaldeko tomate-eremuak aztertzeko sistema britainiarra erabiliz (Cullen et al., 2002), C. coccodes zuten hostoak aurkitu ziren eta zenbait eremutan C. coccodes-ekin kutsatutako hostoen proportzio handia aurkitu zen (Belov et al., 2018). Krasnodar eta Primorsky lurraldeetan, Moskuko eskualdean, tomate fruituak aurkitu genituen, eta horietatik C. coccodes kultura puruak isolatzea lortu genuen. Baliteke C. coccodes gaur egun uste baino askoz ere hedatuago egotea tomatean Errusiakoetan, eta horren kaltegarritasuna ere gutxietsi da.
Horrela, gaur arte, nahikoa informazio pilatu da C. coccodes patatetan eta tomateetan zabalduta dagoen banaketari buruz.
Onddo honek patata eta tomatearen gaixotasunen garapenean duen zeregina hobeto ulertzeko, beharrezkoa da Errusiako prebalentzia kontrolatzea, lurzoruaren eta hazien infekzioen papera eta puntu beltzak biltegiratzean izandako galeretan duen papera aztertzea. PCR diagnostikoak erabiltzeak lan hori nabarmen erraz dezake, eta bi sistema probak aldi berean erabiltzeak analisiaren zehaztasuna nabarmen handituko du.
Lan hori Errusiako Zientzia Fundazioaren 18-76-00009 zk.aren beka baten bidez jaso zen.
Artikulua "Mycology and Phytopathology" aldizkarian argitaratu zen (54. liburukia, 1. zk., 2020).