JAN. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Duela gutxi erakutsi da Ilyonectria crassa onddo askomizetoak patata tuberkuluak infektatzeko gai dela. Lan hau patatatik isolatutako I. crassa anduiaren fungizida batzuen aurkako ezaugarri biologikoak eta erresistentzia aztertzen lehena da. "Patata" tentsioaren espezie espezifikoen eskualdeen sekuentziak lehenago lortu ziren nartziso, ginseng, aspen eta pago, lirio erraboilak eta tuliparen hostoen sustraietatik isolatutako onddoetarako lortutakoekin. Dirudienez, basoko eta lorategiko landare asko I. crassaren erreserba izan daitezke. Ikertutako tentsioak tomate eta patata xerrak kutsatu zituen, baina ez zituen tomate fruta osoa eta osorik patata tuberkulua kutsatu. Horrek I. crassa zauriaren parasitoa dela erakusten du. Fludioxonil, difenokonazol eta azoxistrobinarekiko erresistentzia ebaluatzeak elikagai-euskarri batean botika horien eraginkortasun handia erakutsi zuen.
EC50 adierazlea (fungizidaren kontzentrazioa, koloniaren hazkunde erradialaren erritmoa 2 aldiz moteltzen duena fungizida ez den kontrolarekiko) 0.4koa zen; 7.4 eta 4 mg / l, hurrenez hurren. I. crassa-k eragindako gaixotasuna garatzeko aukera hartu behar da kontuan patata tuberkuluen ebaluazio fitopatologikoa eta landareen babeserako neurriak garatzeko garaian.
Mikroorganismo fitopatogenikoen garapenak galera handiak eragiten ditu patata hazteko eta biltegiratzeko fase guztietan. Babes neurriak planifikatzeko garaian, normalean, patogeno ezagunak hartzen dira kontuan, hala nola Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora eta abar generoko espezieak. Hala ere, azken urteotan patatetan mikroorganismo fitopatogeno berrien agerpenari buruz gero eta txosten gehiago agertu dira. Haien biologia gaizki aztertuta dago, patatetan erabilitako fungiziden eraginkortasuna ez da ezagutzen, diagnostiko metodoak ez dira garatu. Garapen masiboarekin, patata laborantzan kalte handiak eragiteko gai dira. Mikroorganismo horietako bat Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous onddo askomizetoa da, egileek patata tuberkuluetan aurkitu dutena (Chudinova et al., 2019).
Lan honetan patata tuberkuluetatik isolatutako I. crassa andaiaren analisiaren emaitzak aurkezten dira. I. crassaren kolonien eta mizelioen egituren morfologia, espezie espezifikoen DNA eskualdeen nukleotido sekuentziak, patata eta tomateekiko birulentzia eta zenbait fungizida ezagunen aurkako erresistentzia aztertu ziren.
materialak eta metodoak
18an isolatutako I. crassa 2KSuPT2018 andua erabili dugu Kostroma eskualdean hazitako kutsatutako patata tuberkulutik. Tuberkuluari ustel lehor mota batek eragin zion mizelio marroi argiaz estalitako barrunbea. Disekzio orratz antzua erabiliz, onddoen mizelioa Petri plaka batera eraman zen agar ertain batekin (garagardo muztioa% 10, agar% 1.5, penizilina 1000 U / ml). Plakak ilunpean inkubatu ziren 24 ° C-tan.
Leica DM2500 argi mikroskopioa ICC50 HD kamera digitalarekin eta Leica M80 mikroskopio binokularra IC80HD kamera digitalarekin (Leica Microsystems, Alemania) esporeen eta espora organoen tamaina eta morfologia argazkiak ateratzeko, ebaluatzeko erabili dira.
DNA isolatzeko, onddoen mizelioa ilar likido ertainean hazten zen, ondoren nitrogeno likidoan izoztu, homogeneizatu, CTAB bufferrean inkubatu, kloroformoarekin purifikatu eta birritan garbitu zen% 2 alkoholarekin.
DNA erauzteko metodoa zehatz-mehatz deskribatzen da Kutuzova et al. (2017).
Espezieak metodo molekularren bidez zehazteko eta ezagutzen diren I. crassa anduiekin alderatzeko, PCR espezie espezifikoen DNA eskualdeen anplifikazioa ahalbidetzen duten primerekin egin da: ITS1-5,8S-ITS2 (ITS5 / ITS4 primerak, White et al., 1990), gene eskualde b -tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) eta itzulpen luzapen faktorea 1α (tef1α) (primerak EF1-728F / EF1-986R, Carbone eta Kohn, 1999). Nahi den luzerako anplikoniak geletik erauzi ziren Evrogen CleanUp kitarekin. Eskualde anplifikatuak BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, AEB) erabiliz sekuentziatu ziren Applied Biosystems 3730 xl sekuentziadore automatizatu batean (Applied Biosystems, CA, AEB). Lortutako nukleotidoen sekuentziak AEBetako Bioteknologia Informazioko Zentro Nazionaleko (NCBI) GenBank datu-basean bat-etortze bat bilatzeko erabili ziren. Analisi filogenetikoa MEGA 6 programa erabiliz egin da (Tamura et al., 2013).
Birulentziaren zehaztapena fruitu handiko tomate fruitu berde osoekin (Dubrava barietatea) eta patata tuberkuluekin (Gala barietatea) egin zen. Gainera, fruta eta tuberkulu bereko xerrak kaltetutako fruta eta tuberkuluetan kalteak simulatzeko erabili ziren. Tuberkulu xerrak ganbera hezeetan jartzen ziren, Petri ontziak ziren iragazkiaren paper hezea behean. Paperean diapositiba bat jartzen zen, eta, horren gainean, tuberkulu edo fruta xerrak jartzen ziren. Tuberkulu eta fruta osoak beheko aldean iragazki paper bustia duten ontzietan sartzen ziren. Xerraren erdian (edo tuberkuluaren edo fruituaren azalera oso-osorik), agar zati bat (5 × 5 mm) onddo hifasekin jarri zen, 5 eguneko muztioko agarrean hazten egon ondoren.
Onddoen anduek fungizidekiko duten erresistentziaren ebaluazioa laborategiko baldintzetan egin zen agar elikagai ertainean. Maxim, KS (fludioxonil osagai aktiboa, 25 g / l), Quadris, KS (azoxistrobina 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) sendagai fungiziden aurkako sentikortasuna aztertu dugu (Estatu katalogoa ..., 2020). Petri plateretan ebaluazioa muztio-agar ertainean egin zen, aztertutako botikak gehituz 0.1 substantzia aktiboaren kontzentrazioetan; bat; 1 ppm (mg / L) (fludioxonil eta difenokonazolerako), 10; hamar; 1 ppm (azoxistrobinarako) eta fungizidarik gabeko komunikabideetan (kontrola). Fungizida urtu eta 10 ° C bitarteko hoztuari gehitu zitzaion eta ondoren, Petri ontzietara isurtzen zen. Onddo miselioa duen agar bloke bat Petri plaka baten erdian jarri eta iluntasunean 100 ° C-ko tenperaturan landu zen. 60 egun inkubatu ondoren, kolonien diametroak elkarrekiko bi norabide perpendikularretan neurtu ziren; kolonia bakoitzaren neurketaren emaitzak batez bestekoak izan ziren. Esperimentuak hirukoiztu egin ziren. Analisien emaitzetan oinarrituta, EC24 kalkulatu zen, fungizidaren kontzentrazioaren berdina, koloniaren hazkunde erradialaren tasa kontrol fungizidarekiko erdira murrizten zuena.
Emaitzak eta eztabaida
Mota agar duten Petri plaketan, onddoak mikelio flokulente zuriarekin koloniak sortzen zituen. Mizelioaren azpiko ertaina arre gorrixka bihurtu zen. Ertaina lehortzen denean, onddoak bi motatako esporak eratzen ditu esporodokia txikietan konidioforo bakar eta agregatuetan. Makrokonidioak luzeak dira, zilindrikoak, hiru edo septa artekoak, batez besteko luzera 27.2 µm, 23.2 eta 32.2 µm bitarteko balioekin, zabalera - 4.9 µm artekoa (1. irudia). Mikrokonidien batez besteko luzera 14.3 µm da 10.3 eta 18.1 µm bitarteko balioekin, zabalera 4.0 µm artekoa da. Karaktere makro eta mikromorfologiko guztiak Ilyonectria crassa espeziearen aldakuntza barrutian sartzen dira (Cabral et al., 2012).
Espezie espezifikoen DNA eskualdeen sekuentziak (ITS, b-tubulina, TEF 1α) guztiz bat etorri ziren lehenago aztertu genituen I. crassa anduien sekuentziekin (Chudinova et al., 2019, 1. taula). I. crassaren prebalentzia beste eskualde batzuetan aztertzeko eta kaltetutako kulturen espektroa aztertzeko, GenBank datu basean DNA sekuentzia analogikoak aztertu ziren (1. taula). Gainjartzea% 86 eta% 100ekoa zen. I. crassa anda "patata" hiru DNAren eskualde guztien sekuentziak Herbehereetako lirio erraboil eta nartziso sustraietatik eta Kanadako ginseng sustraitik isolatutako andreen sekuentzien berdinak ziren. Ezin izan ditugu beste I. crassa anduiak aurkitu aztertutako hiru sekuentzia analogikoekin datu base irekietan. Hala ere, metatutako ITS eta b-tubulina sekuentzien analisiak I. crassa Erresuma Batuko tuliparen hostoetan duen presentzia erakutsi zuen. Antzeko ITS sekuentzia duten onddoak Kanadan aspen sustraien mikobiotaren eta Italiako pagadi sustraien, Saudi Arabiako patata tuberkuluen (1. taula) analisian identifikatu ziren. Ikerketa honen emaitzek erakusten dute I. crassak banaketa globala duela eta hainbat landare espezie kutsatzeko gai dela.
5. egunean tomate eta patata xerretan patogenotasuna zehazterakoan, lesioaren diametroa 1.5 cm-ra iritsi zen. Ikertutako tentsioak ez zituen tomate fruta osoa eta patata tuberkulu osorik kutsatu. Hala ere, sepaloak tomatearen gainean eragin zituzten. Kutsatzeko aukera baztertzeko, patataren tuberkulu xerra batean garatutako mikelioko onddo isolatu bat kultura hutsean isolatu zen. Gurasoen tentsioaren guztiz berdina zen. Dirudienez, I. crassa zauriaren parasitoa da.
Hazi tuberkuluak fungizidekin landatu aurretik tratatzeak landareen gaixotasunen garapena murrizten du hazkuntza garaian. Fungizida eraginkorrak hautatzeko, garrantzitsua da horietako zein diren I. сrassaren aurka eraginkorrak diren ebaluatzea. Lanak fungizidien substantzia aktibo hedatuak aztertu zituen - fludioxonil, azoxistrobina, difenokonazola. Fludioxonil landatu aurretik haziak eta hazi tuberkuluak janzteko erabiltzen diren hainbat nahasketetan sartzen da. Fludioxonil (Maxim) hazi tuberkuluak biltegiratu aurretik tratatzeko ere erabiltzen da. Difenokonazola eta azoxistrobina ere hazien materiala prozesatzeko erabiltzen diren hainbat prestakinetan sartzen dira, baita landare begetatiboak prozesatzeko prestatutakoetan ere (Estatuko katalogoa ..., 2020).
I. crassa-ren hazkunde-tasa euskarrietan (2. irudia) aztertu zen, substantzia aktiboen kontzentrazio desberdinekin: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxistrobina (EC50 = 4 ppm) eta difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (2. taula). Prestaketa horiek I. crassa-ren aurka oso eraginkorrak direla esan daiteke, haien EC50a tuberkuluak tratatzeko erabilitako lan-fluidoan prestakinaren gomendatutako kontzentrazioa baino askoz txikiagoa baita. Estatuko Katalogoaren arabera ... (2020), fludioxonilaren kontzentrazioa patataren tuberkuluak tratatzeko likidoan 500 eta 1000 ppm artekoa da, azoxistrobina (ildoaren hondoa tratatzeko likidoan) - 3750-9375 ppm, difenokonazola (landare begetatiboak tratatzeko likidoan) - 187.5– 625 ppm.
Taula 1. Genks datu basean eskuragarri dauden 18KSuPT2 and Ilyonectria crassa anduien espezie espezifikoen sekuentziaren sekuentziaren antzekotasuna.
Tentsioa | Landare ostalaria, iraizteko gunea | GenBank-en gordetako sekuentzia zenbakiak, antzekotasunen ehunekoa | Link | ||
ITS | β-tubulina | TEF 1α | |||
17KSPT1 eta 18KSuPT2 | Patata tuberkulua, Kostroma eskualdean | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, lan hau |
CBS 158/31 | Narcissus root, Herbehereak | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lily bonbilla, Herbehereak | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng erroa, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulip hostoa, Erresuma Batua | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen sustraiak, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Pagoa, Italia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Bidalketa zuzena |
KAUF19 | Patata tuberkulua, Saudi Arabia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ez da gordailua
2. taula. Ilyonectria crassak fungizidekiko duen erresistentzia
(substantzia aktiboa) | EC50, ppm | ||||
3 egun | 5 egun | 7 egun | |||
Kontrolatzeko | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxistrobina) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazola) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Gure lanean I. crassa anduiak kostroma eta Moskuko (Chudinova et al., 2019) eskualdeetako patata tuberkuluetatik isolatu ziren. I. crassa-ren berdinak diren ITS sekuentziak dituzten onddoen anduien proportzio handia agerian geratu zen Saudi Arabiako patata-tuberkuluen mikobiota aztertzean (Gashgari eta Gherbawy, 2013). Dirudienez, I. crassa ez da dirudien bezain arraroa patatetan. Gure esperimentuek erakutsi zuten onddoak kaltetutako tomate fruituak kutsa zitzakeela. Literaturaren arabera jakina da I. crassa gai dela lurzoruan saprotrofikoki garatzeko (Moll et al., 2016), baita hainbat landareri ere eragiteko, baita taxonomikoki urrunekoei ere, hala nola nartzisoak, liliak, ginseng-a, aspen-a eta pagoak (1. taula). bat). Dirudienez, basoko eta lorategiko landare asko I. crassaren erreserba izan daitezke. Aurrekoak erakusten du babes neurriak garatzerakoan onddo honekin patata tuberkuluak eragiteko aukera kontuan hartu behar dela. Fludioxonil, azoxistrobina eta difenokonazola duten patata tuberkuluak tratatzeko prestakuntza zabalduek I. crassa-ren aurkako eraginkortasun fungizida handia erakutsi dute.
Lan hori Oinarrizko Ikerketarako Errusiako Fundazioak (20-016-00139 beka) lagundu zuen.
Artikulua "Landareen Babeserako Buletina" aldizkarian argitaratu zen, 2020, 103 (3)